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Este guia abrangente destaca as diferentes categorias de contaminantes da cultura de células e como eles podem impactar sua pesquisa. Nesta edição, também apresentamos os reagentes altamente citados da InvivoGen e perguntas frequentes para ajudar você a manter suas células valiosas protegidas contra qualquer contaminação.

Pequenos organismos, GRANDES problemas

A contaminação microbiana de culturas celulares é uma ameaça séria e implacável à sua pesquisa. Micoplasma, bactérias e fungos podem matar ou alterar drasticamente as células da cultura, levando a resultados desastrosos, perda de tempo e desperdício de recursos. Esta brochura fornece uma visão dos contaminantes com maior probabilidade de invadir suas culturas, as boas práticas para evitá-los e as soluções para eliminá-los. Como especialistas em imunidade inata e microbiologia, sabemos como esses contaminantes biológicos podem interferir nos resultados experimentais. Enquanto as contaminações bacterianas e fúngicas são eventualmente detectadas a olho nu, o micoplasma e as endotoxinas permanecem invisíveis. Contaminantes não detectados são uma preocupação séria, pois podem ter levado à interpretação incorreta dos dados, muitos dos quais foram publicados. Como conseqüência, os periódicos agora pedem frequentemente evidências de ausência de micoplasma e endotoxinas em culturas de células. Empresas farmacêuticas que desenvolvem futuras terapias não podem tolerar contaminações pois elas comprometerão sua pesquisa e reputação. Na InvivoGen, nós nos dedicamos à excelência. Nós fornecemos produtos de alta qualidade e linhas de células livres de micoplasma por todo o mundo. Este guia ajudará você a abordar todos os estágios da infecção microbiana, e escolher o produto InvivoGen correto para detectar, eliminar e evitar contaminações em suas culturas de células.

Suas CÉLULAS SÃO muito preciosas, proteja-as!

Detecção

A contaminação microbiana deve ser detectada o mais cedo possível. Os métodos de detecção dependem da natureza do microorganismo. A detecção inclui o uso de diferentes metologias dentre estas: ensaios biológicos, PCR, fluorescência ou coloração química, microscopia óptica, turbidimetria, medições de pH ou inspeção visual simples. Bactérias e fungos geralmente podem ser identificados por microscopia óptica. Sua rápida taxa de crescimento permite a detecção a olho nu em 48 horas (ou seja, no fi m de semana), as culturas contaminadas parecendo turvas ou irregulares. Posteriormente, a identificação desses microrganismos pode serrealizada com kits de teste. O micoplasma em culturas de células não pode ser detectado visualmente, nem mesmo por microscopia óptica. Portanto, esses micróbios podem passar despercebidos por longos períodos e só podem ser identi fi cados usando ensaios específicos. Várias técnicas de detecção podem ser usadas em conjunto para garanti r uma análise precisa, especialmente para descartar falsos positivos ou esclarecer resultados ambíguos.
 

Prevenção

Conhecer as fontes de contaminação microbiana é crucial para minimizar o risco para as culturas celulares (veja abaixo). Embora a prevenção absoluta seja impossível, você pode tomar várias medidas para prevenir a infecção. Primeiro, verifique se você está trabalhando em um ambiente estéril e usando a técnica assépti ca adequada. Em segundo lugar, coloque em quarentena todas as culturas celulares recebidas até que estas sejam confi rmadas livres de contaminação.
Em terceiro lugar, monitore regularmente as culturas de células em busca de contaminação por kits de microscopia óptica e detecção. Por fim, você pode usar coquetéis de anti bióticos, como os oferecidos pela InvivoGen, projetados especificamente para realizar um ataque preventi vo contra micróbios que seriam
difí ceis de detectar em novas culturas (ou seja, células primárias ou clonagem).
     

Eliminação

Normalmente, uma vez detectados microorganismos invasivos em culturas celulares, recomenda-se descartar as células e os meios. No entanto, algumas culturas de células são tão preciosas que não podem ser perdidas (ou seja, seleção estável de clones, linhas celulares derivadas de tecidos explantados, células primárias) e não estão disponíveis em outros lugares (ou seja, ainda não estão congeladas). Em tais situações, a InvivoGen fornece antibióticos para erradicar a contaminação com segurança e rapidez, sem danificar as células.
 

Contaminações por MICOPLASMA

Os micoplasmas são os organismos auto-replicantes menores e mais simples. Devido ao seu pequeno tamanho (± 100 nm) e devido à falta de uma parede celular rígida, o micoplasma é indetectável por inspeção visual, passa pelo fi ltro padrão e é resistente a um grande número de antibióticos.

A contaminação por micoplasma é um grande problema na cultura de células, afetando a validade dos resultados experimentais, bem como a qualidade e segurança dos biofarmacêuticos baseados em células.

Quais são as características?

O micoplasma pertence à classe dos molicutes, cujos membros se disti nguem por sua falta de parede celular e por sua forma semelhante ao plasma. O micoplasma é altamente infeccioso, para todos os ti pos de células eucarióticas, incluindo células primárias. Centenas de micoplasmas podem se unir a uma única célula, fundir-se com a membrana celular, multiplicar-se e, eventualmente, exceder em número as células cultivadas em 1000 vezes. O micoplasma pode alterar drasti camente as culturas celulares e distorcer os resultados da pesquisa (veja abaixo). Notavelmente, as lipoproteínas do micoplasma são ati vadores potentes das células imunes através do reconhecimento pelo receptor 2 do tipo Toll (TLR2) (3). A ausência de parede celular no micoplasma confere resistência a antibióticos comumente usados, como penicilina e estreptomicina. Além disso, seu tamanho minúsculo (~ 100 nm) não permite sua eliminação pela fi ltragem padrão de 0,2 μm. Assim, são necessárias grandes precauções para evitar a contaminação das culturas celulares.

Os perigos da contaminação por micoplasma

O micoplasma compete com as células hospedeiras por nutrientes e precursores bioquímicos. Como conseqüência, eles alteram muitas funções celulares, como metabolismo e crescimento celular, levando à morte celular. Uma análise de microarranjo em células humanas culti vadas contaminadas revelou os efeitos graves que o micoplasma pode ter na expressão de centenas de genes, incluindo alguns que codifi cam receptores, canais iônicos, fatores de crescimento e oncogenes(4). Após a adesão ou fusão com a membrana da célula hospedeira, eles podem causar mais danos à célula, interferindo nas cascatas de sinalização e na produção de citocinas (5). Esses efeitos prejudiciais podem impactar fortemente os resultados cientí fi cos e invalidar os resultados de um estudo, especialmente quando envolvem células imunes que expressam TLR2, como macrófagos.

DETECÇÃO DA CONTAMINAÇÃO POR MICOPLASMA

   

PlasmoTest™ (link)

Um ensaio celular colorimétrico

Sensível: Limite de detecção 5.102 - 5.105 cfu/ml
Confiável: Sem falsos positivos
Rápido: Manuseio <1 h. Resultados após incubação noturna
Simples: Detecção colorimétrica no sobrenadante da cultura

 
 
As células HEK-Blue -2 proprietárias da InvivoGen expressam de forma estável o TLR2 humano, conhecido por ser o sensor preferencial dos lipopeptí deos de micoplasma1, e um gene repórter SEAP induzível por NF-κB (fosfatase alcalina embrionária secretada). As células HEK-Blue -2 são cultivadas em meio de detecção HEK-Blue, o que facilita o ensaio e o torna ideal para testes de rotina. A simples adição de amostras de teste a essas células fornece resultados colorimétricos com sensibilidade semelhante aos ensaios bioquímicos baseados em luminescência. A ati vidade de SEAP no sobrenadante da cultura pode ser medida a 620-655 nm usando um espectrofotômetro. A absorvância é proporcional à quanti dade de contaminantes.
PlasmoTest™ é fornecido em kit, contendo as células sensores HEK-Blue meio SEAP de detecção de cultura, controles positivos e negativos. Para a sua conveniência as células HEK-Blue são fornecidas com Normocin e um coquetel anti bióti co para evitar a contaminação por micoplasma, bactérias e fungos.
A InvivoGen também oferece agentes removedores de micoplasma altagemente referenciados, Plasmocin e o Plasmocure.
 

 

Produto Descrição Quantidade Código
PlasmoTest™ Mycoplasma contaminati on detection kit 1 kit (250 amostras) rep-pt1
PlasmoTest™ Controle Controls for PlasmoTest™ detection kit 200 testes pt-ctr2
PlasmoTest™ Refil Reagents for PlasmoTest™ detection kit 500 amostras rep-ptrk